L’idea di un museo archeologico prende forma a Siena tra la fine dell’Ottocento e i primi anni del Novecento, all’interno di quelle istituzioni che per vicende diverse avevano visto il formarsi di piccoli nuclei di antichità. Alla progettazione scientifica del museo lavora negli anni Venti il giovane Ranuccio Bianchi Bandinelli: il museo prende forma nei locali di via della Sapienza, dove tra 1931 e 1933 vengono allestiti i materiali provenienti dall’Accademia dei Fisiocritici (rinvenimenti da città e la collezione Mieli, donata al Comune di Siena nel 1882) e la collezione Bargagli di Sarteano trasferita a Siena ad agosto 1931. L’istituzione del regio museo archeologico data al 7 ottobre 1941.
Il patrimonio archeologico continua ad essere incrementato anche negli anni successivi: nel 1951 viene donata allo Stato la collezione di Bonaventura Chigi Zondadari; due anni dopo lo Stato acquisisce la collezione di Emilio Bonci Casuccini, preziosa documentazione dell’archeologia chiusina. Nella seconda metà del Novecento il museo si accresce grazie a rinvenimenti fortuiti dal territorio e agli scavi condotti dalla Soprintendenza.
Alla fine degli anni Ottanta del secolo scorso data il trasferimento del museo all’interno del Santa Maria della Scala: qui va ad occupare i locali che si aprono all’angolo dell’ospedale, l’antico pellegrinaio delle donne e alcuni spazi annessi. Nel 2001 si colloca l’ultimo trasferimento del museo negli ambienti posti al livello più basso del Santa Maria, fatti di cunicoli scavati nell’arenaria e di ampi spazi costruiti a mattoni.